《猫和老鼠》的故事情节围绕着一对常见的家猫汤姆和老鼠杰瑞而展开，汤姆有一种强烈的欲望，总是不断努力的去捉同居一室的老鼠杰利，并不断地努力驱赶着这位讨厌的房客。尽管总是失败，但汤姆在追逐中得到的乐趣远远超过了捉住杰瑞。同时，汤姆在片中经常使用斧头、锤子、炸药、鞭炮等暴力工具或陷阱来对付杰瑞。但杰瑞非常机灵，时而使汤姆的诡计适得其反，让汤姆自食其果。在这部动画中，没有动物世界中恃强凌弱的残酷，只有两个邻居之间的日常琐事和纷争.


汤姆（猫）
演员 ---

总是闪着机会主义的光芒，弓着腰在一旁等待机会出击杰瑞。在动画片中，它总有一种强烈的欲望，总想抓住与它同居一室却难以抓住的老鼠杰瑞。但总是遭到失败。而实际上它在追逐中的乐趣远远超过了抓住杰瑞，即使偶尔抓住了杰瑞，也不知道怎么处理杰瑞，也许是他们在不知不觉中已经成为对方生活中不可或缺的一个角色了。
杰瑞（鼠）
演员 ---

总是用挑逗的眼神看着镜头，并且常常在不经意期间玩弄汤姆。因为杰瑞古灵精怪，所以经常能成功的戏弄汤姆且让他糗事百出，不过有时他也会被汤姆戏弄，时而在戏弄汤姆的同时也会享受到汤姆对它的关心，让它感动。
两只鞋太太（人）
演员 ---

动画中汤姆猫的几种不同主人中最常出现的一位，经常处理两位主角在自己家中所制造的麻烦。由于视角问题，镜头只能看到她腰以下的部位。在动画中的设定大约40岁左右，身材粗壮的大妈形象。1952年之后不再登场。
斯派克（狗）
演员 ---

一只凶猛的斗牛犬，不管是汤姆有意拿他寻开心、还是捉杰瑞时不小心的、或者是杰瑞栽赃嫁祸的，汤姆总能招惹到他，因此总是被它暴打一顿。
泰克（狗）
演员 ---

斯派克的儿子，经常被汤姆和杰瑞的打闹无辜牵连，是斯派克爆打汤姆的主要原因之一。

泰菲（鼠）
演员 ---

一个由杰瑞收养的小灰鼠弃儿，个体娇小可爱，通常穿白色尿布，非常贪吃，会讲法语，无时无刻不在卖萌。